Sujets de thèse et de Mastère proposés pour 2014/2015

2014

 

Sujet de thèse N°1: Clonage positionnel des déterminants génétiques de la tolérance au gel au QTL du groupe de liaison 3 de Pisum sativum (contact: B. Delbreil) ATTRIBUE

Le pois est une espèce qui doit son intérêt agronomique à sa capacité à développer une fixation symbiotique de l'azote atmosphérique et à la forte teneur en protéines de ses graines. De par leurs moindres besoins en intrants, le pois a un rôle privilégié à jouer dans des systèmes culturaux respectueux de l'environnement. Des programmes de sélection ont été mis en œuvre pour développer des variétés d'hiver avec un rendement plus élevé et plus stable, grâce à un cycle de développement plus long. Dans le contexte actuel du réchauffement climatique, l'augmentation prévisible de la température, avec notamment des températures plus douces en automne, conduira à un accroissement des dommages dus au gel sur des tissus végétaux insuffisamment acclimatés. Il est ainsi essentiel d’accroître nos connaissances dans les mécanismes mis en place lors de la réponse au froid chez les plantes, afin de relever les enjeux de ce changement climatique. Dans ce cadre nous avons révélé trois zones du génome (QTL) impliquées dans la tolérance au gel et identifié les gènes sous-jacents à l’un de ces QTL.

L’objectif de la thèse est de réaliser le clonage positionnel des gènes présents sous le QTL le plus explicatifs de la tolérance à l’hiver (QTL WFD3.1). Pour cela nous proposons :

- de réduire l'intervalle de confiance au QTL WFD3.1;

- de réaliser un clonage positionnel des candidats au QTL WFD3.1 ;

- d'établir une hiérarchie entre les gènes candidats potentiels en analysant leur expression au cours de l'acclimatation au froid chez le pois (QTL-NIL);

- de valider l'expression des candidats les plus pertinents (Tilling et/ou VIGS).


Sujet de thèse N°2: Caractérisation des voies de biosynthèse des esters d'acide caféique chez la chicorée (contact: D. Gagneul, J-L. Hilbert) ATTRIBUE
Les plantes accumulent des métabolites dits secondaires dont les propriétés permettent d'envisager des utilisations dans des domaines très variés de l'activité humaine. Ces composés sont classés en 3 groupes distincts : les terpènes, les alcaloïdes et les composés phénoliques. Les chicorées accumulent 4 composés phénoliques majeurs, les acides chlorogénique, isochlorogénique, caftarique et chicorique, dont le point commun est la présence d'au moins un groupement caféoyle. Ainsi, les acides chlorogénique et isochlorogénique sont des esters d'acide quinique et d'acide caféique tandis que les acides caftarique et chicorique sont des esters d'acide tartrique et d'acide caféique. Si l'acide chlorogénique est présent chez de nombreuses espèces végétales, l'accumulation des 3 autres composés est beaucoup plus originale et la chicorée représente une source quasi unique pour ces molécules. Sur le plan biochimique, seule la voie de biosynthèse de l'acide chlorogénique est décrite dans la littérature. Ce projet  a pour objectif l'identification de déterminants moléculaires à l'origine de la production de ces molécules originales chez la chicorée. Par une approche multidisciplinaire, le projet de thèse visera à

1) définir une liste de gènes candidats à partir des données de la littérature et des résultats acquis au laboratoire

2) caractériser par PCR quantitative l'expression de ces gènes dans différentes conditions et différents organes ou modèle en relation avec la production de ces métabolites

3) caractériser les enzymes identifiées (spécificité de substrats, pH optimal, mode d'action..)

  1. 4)intégrer des résultats de profilage métabolique et transcriptomique (NGS) afin de dégager les déterminants à l'origine de la régulation de l'accumulation de ces composés chez la chicorée.



Sujet de MASTERE N°1: Vernalisation chez les chicorées (contact: T. Cadalen, C. Vuylsteker)
La vernalisation est l'acquisition de la compétence à fleurir suite à un traitement au froid. Pour les espèces bisannuelles, le traitement au froid est impératif. La vernalisation n'intervient pas directement sur l'initiation de primordia floraux mais rend la plante apte à fleurir lors du retour de températures ou/et d'une photopériode favorables.

La chicorée est une Asteracée bisannuelle dont les mécanismes de vernalisation sont peu connus et par là même la vernalisation en conditions contrôlées est mal maîtrisée. La construction des variétés industrielles a visé à contre-selectionner des plantes sensibles à la montaison car elles présentent des rendements en racines défavorables pour les applications agro-industrielles (inuline, chicorée torréfiée).

Pour aborder de façon plus complète des mécanismes de vernalisation, il faut donc repartir sur des populations sauvages. Nous disposons déjà de ces populations sauvages contrastées pour leurs besoins en vernalisation. Au cours du stage, une structuration de la variabilité de ces populations de chicorées sera réalisée à l’aide de  marqueurs moléculaires.

La recherche exhaustive des gènes orthologues impliqués dans la réponse à la vernalisation chez d'autres modèles végétaux sera entreprise chez la chicorée (partie codante et si possible éléments de régulation). Pour cela, nous disposons du séquençage de chicorée industrielle et d’éléments de transcriptome disponibles qui permettront d'entreprendre cette recherche.

Parmi les gènes impliqués chez Arabidopsis thaliana, il a été démontré que les espèces annuelles ont évoluées à partir des bisannuelles, par mutation par insertion de transposons dans le Flowering Locus FLC qui code une protéine agissant comme répresseur de la floraison et mutations-délétions dans FRIGIDA (FRI) est un activateur de FLC. Si un homologue FLC-LIKE1 (CiFL1) a été identifié chez la chicorée industrielle et la séquence publiée, aucune séquence de FRI et FRI like n'a encore été publiée chez la chicorée.

Le stage comprendra une mesure du polymorphisme allélique existant au sein des populations de chicorée sur ces deux gènes. Pour se faire, après une définition d'amorces spécifiques en vue d'amplifier les séquences des gènes cibles (UTR, exons, introns, promoteur), il sera procédé à un séquençage des allèles des candidats chez des individus issus des populations contrastées. L’objectif de ce stage sera de déterminer si le polymorphisme allélique aux gènes cibles pourrait être relié à la variabilité de réponse au froid pour un mécanisme dont on s'attend à une composante épigénétique importante.

Techniques employées Bio-informatique (recherche et annotation de séquences sur le génome de chicorée) et Biologie Moléculaire (Extraction d'ADN, génotypage SSR, Définition d'amorces, Amplification PCR, Clonage, Réactions de séquences)


Sujet de MASTERE N°2: Caractérisation de molécules bioactives issues de différentes sources de chicorées (contact: C. Rambaud, J-L. Hilbert)
Les végétaux sont capables de produire et d'accumuler une très grande diversité de molécules issues du métatobolisme secondaire, qui interviennent entre autre dans les phénomènes d’interactions plante/environnement mais qui présentent aussi des propriétés multiples : antimicrobienne, antifongique, antioxydante, hépatoprotectrice, etc…
La chicorée est déjà connue pour ses nombreux bienfaits sur la santé. Dans le but de caractériser de nouvelles molécules bioactives, des extraits de chicorée provenant de différentes sources de chicorée seront testées pour leurs activités biologiques en collaboration avec le ANDI Centre of Excellence  for Biochemical and Biomaterials de l’Université de l’Ile Maurice (professeur T. Bahorun.
Les extraits de chicorée seront préparés à partir de cultures classique, hydroponique, cultures cellulaires ou hairy roots. Une comparaison des différents systèmes de culture sera entreprise quant à leurs activités biologiques (antioxydante, hépatoprotectrice…).


Sujet de MASTERE N°3: Identification des composés impliqués dans les propriétés sensorielles de la racine de chicorée torréfiée (contact: P. Hance, J-L. Hilbert)

La racine de chicorée industrielle (Cichorium intybus var. sativum) est utilisée dans le domaine agro-alimentaire sous formes séchées ou torréfiées. La composition phytochimique de la racine est un déterminant important de la qualité alimentaire des produits dérivés. L’amertume est à ce titre une caractéristique organoleptique majeure de la chicorée et contribue à moduler les préférences de consommation des produits torréfiés. Si dans la racine brute cette saveur implique des lactones sesquiterpéniques issues du métabolisme secondaire, nous avons démontré que ces composés se trouvent en très faible quantité après torréfaction en dépit du degré d’amertume persistant.

Dans le but d'isoler et d'identifier les composés responsables de l'amertume dans les produits torréfiés, nous avons engagé une approche de fractionnement senso-guidé. En collaboration avec le département Génie Biologique de l’IUT A de Lille 1, la démarche suivie amènera le/la candidat(e) à fractionner les produits en utilisant une gamme de méthodes séparatives (extraction liquide-solide, chromatographie flash et HPLC préparative). Conjointement, l'évaluation sensorielle s'attachera à identifier les fractions amères et à caractériser la perception temporelle et l'intensité de l'amertume. La caractérisation chimique (UPLC-DAD, LC-MSn) des fractions sélectionnées permettra d'isoler les composés amers et de confirmer leur occurrence dans les produits torréfiés.

Ce travail s’inscrit dans le cadre d’un programme de recherche et d’innovation pour le développement de nouveaux produits chicorée. Les connaissances acquises au cours du stage doivent notamment contribuer à éclairer la dynamique moléculaire de l'amertume et à mieux comprendre la formation des propriétés organoleptiques en lien avec la torréfaction de la racine de chicorée.


Sujet de MASTERE N°4: Caractérisation biochimique d'enzymes impliquées dans le métabolisme des phénylpropanoïdes (contact: D. Gagneul, J-L. Hilbert)

Les composés phénoliques issus de la voie des phénylpropanoïdes sont des métabolites secondaires rarement présents sous forme libre dans la plante. Ils sont le plus souvent conjugués à des sucres ou à des acides pour former des glucosides ou des esters, respectivement. Nous nous intéressons à des esters de composés phénoliques produits et accumulés par la chicorée industrielle. L'objectif de ce projet est de comprendre à la fois le rôle physiologique de ces composés mais également d'élucider leurs voies de biosynthèse, celles-ci étant incomplètes. La mise à jour des déterminants moléculaires à l'origine de leur production est nécessaire à la mise en place des démarches de sélection. Ces composés sont, en effet, une cible intéressante en sélection du fait de leur rôle bénéfique sur la santé humaine. Ce projet de stage a pour but la caractérisation biochimique d'enzymes dont les gènes ont été sélectionnés in silico. Ces gènes seront clonés puis des protéines recombinantes seront produites en système hétérologue. Leurs activités seront ensuite appréhendées in vitro. Outre la validation de leur rôle biochimique, ces enzymes seront caractérisées très précisément (Km, spécificité de substrats...). Au cours de ce stage, des méthodes de biologie moléculaire et de biochimie seront développées.


Sujet de MASTERE N°5: Les composés phénoliques antimicrobiens du houblon, une plante d’intérêt pour la région Nord-Pas-de-Calais (contact: C. Rivière : celine.riviere-3@univ-lille2.fr, S. Sahpaz : sevser.sahpaz@univ-lille2.fr)

Ce projet vise à développer nos connaissances sur le mécanisme d'action antibactérien de composés du houblon (Humulus lupulus L., Cannabaceae), plante médicinale et alimentaire d'intérêt économique cultivée dans le Nord de la France, sur des souches de Staphylococcus aureus résistantes à la méthicilline. Certains métabolites du houblon, en particulier l’humulone, la lupulone et le xanthohumol, bien qu’ils soient connus pour être antibactériens, ne sont pas exploités contre l'émergence de bactéries résistantes aux antibiotiques. Ces substances naturelles sont aussi d'un grand intérêt potentiel pour les industries cosmétique, agro-alimentaire et pharmaceutique, qui recherchent des substituts aux conservateurs de synthèse dont les effets secondaires ont été récemment dénoncés. Ce projet ambitieux et collaboratif utilise une approche globale pour une meilleure compréhension de la diversité génétique des variétés de houblon et des voies métaboliques de leurs polyphénols qui conduira à une meilleure connaissance de la variation de leur métabolome et de leur activité antibactérienne.

Par une approche multidisciplinaire, le projet visera :

1) le profilage métabolomique et la déréplication d’extraits bruts et de fractions enrichies de cultivars de houblon par chromatographie liquide haute performance (CLHP) couplée à la détection UV et à la spectrométrie de masse (LC-DAD-MSn), ainsi que la purification des composés phénoliques minoritaires par chromatographie par partage centrifuge (CPC).

2) l’évaluation de l’activité antimicrobienne des extraits et composés phénoliques purifiés sur des souches bactériennes résistantes. L’identification et la caractérisation de gènes régulateurs du métabolisme des acylphloroglucinols et/ou des chalcones prénylées du houblon par le biais des biotechnologies végétales, pourront être envisagées en lien avec le Dr D. Gagneul et le Dr C. Rambaud.