Transcription inverse et marquage des cibles*
 
Pour chaque cible, 10 µg d'ARN total, sont soumis à une réaction de transcription inverse en présence de dCTP marqués avec les cyanines 3 ou 5 (Cy3 ou Cy5) (Amersham). Les ARN et 3 µg d'oligo d(T) (Roche) sont placés dans un volume total de 16 µl puis dénaturés pendant 5 min à 70°C et refroidis sur glace. Aux ARN et oligo d(T) sont ajoutés 10 µl d'un mélange contenant le tampon 5 de la transcriptase inverse (Invitrogen) (250 mM de Tris-HCl pH 8,3, 375 mM de KCl, et 15mM de MgCl2), ainsi que 30 mM de dithiothreitol, 0,5 mM de dATP, dGTP et dTTP (Roche), 0,2 mM de dCTP (Roche) et 16 U de RNAsine (Promega). Au volume total sont ajoutés 2µl de dCTP-Cy3 ou de dCTP-Cy5 suivant les cibles. Le mélange est incubé 2 min à 42°C avant d'ajouter 400 U de SuperscriptII (Invitrogen). La réaction de transcription inverse se déroule 2 h à 42°C. Les ARN sont ensuite dégradés par un ajout de 15 µl de NaOH 0,2 M, suivi d'une incubation de 15 min à 65°C. L'arrêt de la réaction est réalisé par ajout de 15 µl de HCl 0,2 M.
Les cibles marquées au Cy3 ou au Cy5 sont ensuite mélangées suivant les plans d'expérience et purifiées à l'aide du kit PCR Cleaning Kit (Qiagen). Le volume total obtenu peut être réduit jusqu'à environ 8 µl à l'aide d'un Speed Vac. La qualité des sondes obtenues est contrôlée par un spectre d'absorption de 220 à 700 nm.
* Des protocoles spécifiques sont employés pour les lames CATMA ou Ps6kOLI1.

 

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