Blocage des lames
La neutralisation des groups réactifs du revêtement de la lame doit être réalisée avant l’utilisation de la lame.
Blocage pour les lames Nexterion
Blocage pour les lames Codelink

Sortir la lame à la T° ambiante 5 min
Lavage 5 min en solution 1 T° ambiante (
Solution 1: 250 ml H2O MiliQ, 250µl Triton x 100. Dissoudre à 80°C 5 min et faire revenir à la T° ambiante)

Conservation des lames après dépôt 12h à 95% d'humidité.

Lavage 2 fois 2 min en solution 2 T° ambiante (Solution 2: 500 ml H2O MiliQ, 58µl HCL 32%)

Traitement avec solution de blocage (50 mM de Trizmahydrochloride, 50 mM de Tris(hydroxymethyl)aminomethane et 0,3% d'éthanolamine, pH 9) contenant 0,1% de SDS pendant 30 min à 50°C.

Lavage 10 min en solution 3 T° ambiante (Solution 3: 225 ml H2O miliQ, 5 ml KCl 1M)

Lavage des lames par deux bains successifs d'eau distillée à température ambiante, suivis d'un bain de SSC 4 contenant 0,1% de SDS pendant 60 min à 50°C

Lavage 1 min H2O MiliQ T° ambiante
Lavage 15 min en solution 4 à 50°C en agitation (
Solution 4 : 45ml H20 MiliQ, 13,8 µl HCl 32%, laisser à 50°C. Pas plus de 5 min avant l’utilisation, rajouter 15 ml solution de blocage 4xNexterion. Laisser à 50°C)

Différents bains d'eau distillée : 1 min à température ambiante, 2 min à 95°C et deux bains successifs de 2 min dans de l'eau distillée à température ambiante.
Lavage 1 min avec H2O MiliQ T° ambiante
Centrifuger 5 min à 1200 rpm ou sécher à l’air comprimé.
Secher les lames par centrifugation 5 min à 1200 rpm ou à l’air comprimé.
 
Hybridation
A chaque paire de cibles est ajouté du tampon d'hybridation DIG Easy (Roche) jusqu'à un volume final de 60 µl. Les ADNc marqués sont dénaturés pendant 1min à 95°C avant d'être déposés sur les lames, recouvertes ensuite d'une lamelle. Les lames sont placées dans des chambres d'hybridation (Corning), contenant dans des cupules, 15 µl de tampon d'hybridation, afin de maintenir une humidité constante au sein de la chambre. Les chambres d'hybridation, une fois fermées, sont incubées 14-16 h dans un bain-marie à 42°C.
Chambre d'hybridation Corning
 
Lavage des lames
Après hybridation, les lamelles sont retirées dans un bain de SSC* 4x à 42°C. Les lames sont ensuite lavées par deux bains successifs de 5 min à 42°C dans du SSC 2x contenant 0,1% de SDS**, par un bain de 1 min à température ambiante dans du SSC 0,2% , et par un bain d'1 min à température ambiante dans du SSC 0,1x . Les lames sont séchées par 1 min de centrifugation à 180 g. La fluorescence est préservée sur les lames en condition d'obscurité, durant plusieurs semaines.
* SSC = Saline-sodium citrate 20x composé de chlorure de sodium (17.5%) et de citrate tri-sodique (8.8%)
** SDS - Dodécyle sulfate de sodium
Bains de lavage des lames sur agitateur Stuart
Centifugeuse Telechem pour secher les lames

 

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